自身免疫性视网膜病变血清抗视网膜抗体的检测

曾惠阳  刘谦  彭晓燕

【摘要】 目的 探讨自身免疫性视网膜病变（autoimmuneretinopathy，AIR）患者血清抗视网膜抗体（anti-retinal antibodies，ARA）检测的临床应用价值。设计 前瞻性比较性病例系列。研究对象 临床疑似 AIR 患者、健康人对照及其他视网膜病变对照包括原发性视网膜色素变性（retinitis pigmentosa，RP）、双眼葡萄膜炎、白点综合征患者。方法 选取 2016年9月-2018年5月北京同仁医院就诊的临床疑似AIR患者17例作为实验组，健康人20例作为对照组，RP患者18例、双眼葡萄膜炎患者9例、白点综合征患者6例作为其他视网膜病变对照组 。通过免疫印迹法检测各组受检者血清ARA，比较各组的阳性率及差异 。主要指标 血清恢复蛋白（recoverin），烯醇化酶α（ α-enolase），碳酸酐酶 II（Carbonic anhydraseII ，CA II），塌陷反应介导蛋白5（Collapsin response mediator protein 5，CRMP5）抗体 。结果 临床疑似AIR组、其他视网膜病变对照组及健康人部分受试者血清中均有不同种 类 ARA 检出 。一种或两种以上抗体表达阳性率在临床疑似AIR组分别为76.5%及64.7%，在其他视网膜病变对照组分别为54.5%及30.3%，在健康受试者分别为33.3%及0%。RP患者抗体阳性率为33.3%。各组中以 α-enolase及CA II 抗体表达阳性率最高；recoverin抗体特异性存在于癌症相关性视网膜病变患者（Cancer-associated retinopathy, CAR）血清中 。结论 临床疑似AIR患者血清中ARA存在率较高，明显高于健康人及RP患者；二个以上ARA表达明显高于其他视网膜病变 ，故对该疾病具有重要辅助诊断价值 。血清ARA的存在必须与临床体征结合才能确诊AIR。（眼科，2018，27：451-455）

【关键词】自身免疫性视网膜病变；抗视网膜抗体

自身免疫性视网膜病变（autoimmuneretinopahy，AIR）是一类由免疫炎症介导的可致盲性眼病， 患者表现为双眼无痛性亚急性视力下降，视网膜电图（electroretinography，ERG）异常，循环血清中存在自身抗视网膜抗体（anti-retinal antibodies，ARA）等^[1-2]。该类疾病分为副肿瘤（paraneoplastic，p-AIR）及非副肿瘤性AIR（non-paraneoplastic ,np-AIR）。p-AIR包括癌症相关性视网膜病变（cancer-associated  retinopathy ,CAR）、黑色素瘤相关性视网膜病变  melanoma-associated retinopathy，MAR）及良性肿瘤引起的视网膜病变。np-AIR无系统性肿瘤存在。2016年发布的np-AIR的诊断及治疗共识^[3] 中指出：血清ARA检测为诊断AIR的基本标准之一。在我国，对AIR的漏诊、误诊，延误治疗、盲目治疗的情况普遍存在。究其原因，除了疾病发病率低，临床体征隐蔽，对该病变认识不足外，缺乏血清ARA检测也是重要因素。本文研究目的是探讨AIR患者血清ARA检测及其临床应用价值。

资料和方法

一、一般资料

选取2016年9月至2018年5月于北京同仁医院就诊的连续的17例临床疑似AIR患者（包括np-AIR及p-AIR）作为研究对象 。纳入标准：依据2016年发布的关于np-AIR的诊断及治疗共识^[3], 临床基本诊断标准包括：双眼视功能异常没有其他明显病因可以解释；ERG 异常（伴或不伴有视野异常）；无明显眼底病变或引起视功能丢失的视网膜变性疾病；无明显眼内炎症。支持性诊断标准：出现闪光感、暗点、色盲或夜盲或畏光；个人或家族性系统自身免疫性疾病；视力变化较快（急性或亚急性）^[3]。p-AIR患者除存在系统肿瘤外其他与np-AIR诊断标准相同 。选取典型原发性视网膜色素变性（retinitis pigmentosa，RP）18 例、双眼葡萄膜炎9例、白点综合征6例、健康人20例作为对照组。健康受试者标准：无明显眼部疾病、视功能无明显异常。本研究通过北京同仁医院伦理委员会批准，符合赫尔辛基宣言关于临床研究的基本原则。

二、血清样本收集

经患者肘静脉抽取静脉血3ml ，以1500rpm的离心速度离心5min, 离心后分离出血清，置-80℃冰箱中保存。检测时，取出解冻至4℃待用。

三、免疫印迹法检测血清ARA

将恢复蛋白（recoverin）、烯醇化酶α（α-enolase）、碳酸酐酶 II（carbonic anhydraseII，CA II）、塌陷反应介导蛋白 5（collapsin response mediator protein  5 ,CRMP5）四种蛋白（ATGen 公司）稀释并混合，取8μl每孔上样 ,  以100V , 100min实施电泳，100V ,60min进行转膜 ，转印后的PVDF膜于5%脱脂奶粉中封闭60min 。取其中一泳道作为阳性对照组，以一定的稀释比例加入一抗：recoverin抗体（26KD，millipore公司）、α-enolase抗体（47KD，an ta Cruz 公司）、CA II 抗体（29KD，Abcam公司）及CRMP-5抗体（88KD，GeneTex公司）。其他泳道加临床疑似AIR组或对照组血清或不加一抗作为阴性对照 。血清稀释一定浓度后4℃孵育过夜 。二抗1：2000室温孵育60min，ECL发光显影 。检测各组患者或健康人血清中recoverin，α-enolase、CA II及CRMP-5抗体的表达 。对比临床疑似AIR组（包括p-AIR及 np-AIR患者）及对照组ARA阳性率；特别对比与AIR患者临床体征极为相似的RP患者之间的差异。

四、统计学方法

使用SPSS19.0软件进行统计学分析 。组间率的比较采用X2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结       果

一、临床疑似AIR组及对照组血清ARA表达

图1 显示ARA表达阳性的临床疑似AIR组及对照组检测结果。临床疑似CAR患者血清recoverin（26 KD）抗体表达强阳性，α-enolase 抗体（47 KD）弱阳性（泳道 B）。其他视网膜病变对照组包括部分RP、双眼葡萄膜炎、白点综合征中亦有不同种类不同程度ARA阳性表达（C~E 泳道），健康人血清微CA II弱阳性表达（F 泳道）。A泳道为阳性对照；G 泳道为阴性对照（PBS取代一抗）。

二 、临床疑似AIR组及对照组血清ARA阳性率比较

临床疑似AIR及对照组ARA阳性表达例数见表1、2。结果显示，一个及以上抗体阳性表达率在临床疑似AIR组为76.5%，在其他视网膜病变对照组为54.5%，在健康人血清中为33.3%；临床疑似AIR组与其他视网膜病变对照组之间无显著性差异（X2=2.28，P=0.13），但显著高于健康人对照组（X2=6.57 , P=0.010）。两个及以上抗体阳性率在临床疑似AIR组为64.7%，在其他视网膜病变对照组为30.3%，二者之间有显著性差异（X2=5.45 ,P=0.019）（表1）。

RP患者ARA抗体阳性率为33%，明显低于临床疑似AIR组（76.5%）（X2=6.56，P=0.011）。其中1例CAR患者无ARA表达，患者有盆腔肿瘤切除及大剂量放化疗史 。葡萄膜炎及白点综合征患者抗体阳性率与临床疑似AIR组无显著差异 。α -enolase及CAII抗体表达居于临床疑似AIR组及其他视网膜病变对照组前两位（在临床疑似AIR组分别为76.4%及51.5%；在其他视网膜病变对照组分别为29. 1%及42.4%）。Recoverin抗体特异性表达于CAR患者血清中，在np-AIR及对照组中均未发现 。CRMP-5抗体各在1例葡萄膜炎及白点综合征患者血清中表达（表2）。

讨        论

AIR是进行性发展的可致盲性眼病 , 虽然发病率低且临床症状隐匿 ,但由于双眼视力可在短期内持续下降而极易引起患者恐慌 。随着影像学技术的发展及病变知识的普及，临床疑似病例不断被发现，但国内一直缺乏较全面、可靠的血清 ARA检测，误诊、漏诊、延误治疗的情况非常普遍，患者视功能预后较差 。基于该现状，本研究采用免疫印迹法检测临床疑似AIR血清中多种ARA的存在，以协助明确诊断，尽早介入治疗。本研究设立对照组，除了健康人，还包括血清中亦可能出现非致病性ARA的视网膜病变患者^[4]尤其RP，后者临床特点与AIR极为相似，最易引起误诊。研究结果显示：虽然临床疑似AIR组、对照组部分其他视网膜病变患者及健康人血清中均有ARA表达，但前者单个及以上抗体总阳性率（76.5%）显著高于健康人对照组及RP患者，两个及以上抗体阳性率（64.7%）显著高于其他视网膜病变。Recoverin抗体特异性表达于CAR患者血清中。上述结果提示：可以通过血清学ARA检测为确诊临床疑似AIR提供实验室依据，二个以上抗体存在的临床意义更加明显 。此外，还可以此与某些疾病进行鉴别诊断。

AIR的发病机制普遍认为与血清中存在ARA密切相关。由于肿瘤细胞、病毒或细菌等外界因素侵入，机体产生与视网膜某组织细胞结构相似的抗体释放入血清，破坏血-视网膜屏障 ,与视网膜结合发生抗原抗体反应诱导细胞死亡而发病^[5]。AIR发病率较低 ,与起病隐匿，迄今尚无统一的诊断及治疗标准、血清学诊断未标准化有关 ,大量潜在AIR患者未被诊断或仅临床疑似。基于上述现状，2016“美国葡萄膜炎协会 ”发布了关于np-AIR的诊断及治疗共识^[3]，提出5条基本诊断标准，3条支持诊断标准，其中血清ARA的存在是基本诊断标准之一。p-AIR除存在系统性肿瘤外余诊断标准与np-AIR相同 。国内既往对临床疑似AIR患者偶有报道，其中黄厚斌等^[6]报道副肿瘤相关性视神经视网膜病变患者8 例并对 其进行了血清抗自身抗体检测，包括Ma2、CV2/ CRMP5及其他抗神经元抗体。总的来说，上述个案报道或因缺乏血清学证据无法确诊，或无公认的视网膜特异性抗体，如 recoverin、α—enolase 及CA II的检测说服力不足 。本文是目前国内较全面进行血清ARA检测的研究。结果显示临床疑似AIR血清ARA的存在率达到76.4% 。有4例患者ARA表达呈阴性，其中1例已进行盆腔恶性肿瘤扩大切除及大剂量放化疗。其他可能的原因包括患者可能表达除文中4种抗体以外的其他ARA；目标抗体有可能不被现有检测手段检出。后者的比率约为10%~20%^[5]。

本研究结果显示：α-enolase 及CA II抗体在临床疑似AIR及其他视网膜病变对照组部分患者中检出率最高，而recoverin抗体特异表达在CAR患者血清中。自身免疫性抗体种类繁多，除了本文中常见的4 种，还包括热休克蛋白70、arrestin、trans ducin a/β、TULP1、TRIMP 等近17 种 ，但大部分致病性不明，有些被认为仅为对原发病变的继发免疫反应 ^[7-8] 。 Recoverin蛋白（23 KD）于1976年首次在CAR病例中发现^[9]，它位于光感受器层，体内及体外实验均证实该抗体可通过Caspase依赖的细胞凋亡途径导致光感受器死亡，是CAR致病最主要的自身免疫性抗体^[10]，在恶性肿瘤中表达率为10%。Recoverin抗体阳性表达提示患者疾病进展快、预后较差^[10-12] 。本研究中recoverin抗体特异表达在2例CAR患者血清中，其中1例发现呈强阳性表达后再进行肺部CT检查发现恶性占位。良性肿瘤所致p—AIR、np—AIR、健康人及其他视网膜病变患者均无recoverin表达。α-enolase 和CAII抗体在各组中检出率最高，与国外文献报道一致^[1]。α-enolase蛋白主要表达于视杆细胞 、双极细胞和视神经组织。与recoverin相似，它可表达于大部分恶性肿瘤并引起血清相应抗体升高导致光感受器死亡^[11] 。α-enolase抗体阳性的AIR患者病程进展相对缓慢，提示其毒性作用可能较recoverin弱^[1]。CA II抗体定位于光感受器、内核层及节细胞层，目前仅体外实验显示其可引起视网膜细胞凋亡^[12]。CRMP—5抗体在本研究中仅在2例非AIR视网膜病变血清中表达，其意义不清。该抗体主要表达于视神经髓鞘内的少突细胞 ，被认为与自身免疫性视神经病变（paraneoplastic  optic neuropathy，PON）发病相关^[7]。我们的研究未发现同时合并PON的病例。

本研究中其他视网膜病变对照组ARA阳性率为54.5%，其中部分RP、白点综合征，葡萄膜炎患者均有ARA表达，与文献报道一致^[1-2]。ARA在某些变性及炎症性疾病中存在的作用和意义还不十分清楚。RP是最易于与AIR临床体征相混淆的视网膜病变，误诊时有发生。文献显示RP患者血清ARA的检出率为10%~37%^[2]，抗体阳性的RP患者更容易出现黄斑水肿，但二者之间的关联尚不清楚。本研究中RP患者ARA阳性率明显低于临床疑似AIR患者，对鉴别诊断有一定价值。本研究中83%（5/6例）白点综合征患者血清ARA表达阳性，与文献报道相似^[13]，但该病变临床特征独特，预后明显较AIR为佳，且有自愈倾向，不难与AIR鉴别。葡萄膜炎ARA阳性率亦较高，但因其眼内炎症特征明显而较易于明确诊断。既往报道显示正常人血清中也有ARA存在^[14]，本研究证实了这一发现，但阳性率较AIR为低。ARA可能出现在上述变性或炎症疾病发生之前，也可能只是原发视网膜病变组织损伤的结果。目前观点倾向于上述病变血清中的ARA不具有原发致病性，不会主动破坏血—视网膜屏障与视网膜神经元结合产生毒性反应，但可能会加重炎症反应的进程^[15] 。综上所述，需要特别强调的是，ARA的存在是诊断AIR的必要条件而非充分条件，单纯血清ARA存在不具有诊断意义，必须与临床体征及辅助检查相结合才能确诊AIR。

本研究在国内首次对中国人疑似AIR患者进行了recoverin、α—enolase及CA II等公认具有视网膜特异性及致病性血清ARA的检测，为确诊AIR提供更为可靠的血清学依据。此外，还就ARA在AIR及其他视网膜病变及健康人血清中的表达率进行了分析。结果显示：除了抗体种类（如recoverin在CAR患者的致病性高于α-enolase及CA II）^[3]，ARA存在的数量也具有一定临床意义，血清中二个及以上ARA表达发生AIR的可能性要高于一个抗体，该结论与文献报道一致^[3]。

本研究的不足之处在于检测抗体数量有限，可能导致部分受检者ARA表达假阴性，但除recoverin、α-enolase 及CA II 之外其他ARA的致病性尚有待于证实 。此外，在免疫印迹法的基础上，还可联合其他方法如免疫组化法（以人视网膜组织切片为 反应抗原）进一步提高检测的特异性并了解ARA在视网膜中的定位 。少数研究使用酶联免疫法进行血清ARA检测，实际操作中因缺乏商业化目标抗原包被试剂盒、耗费患者大量血清以及不能同时进行多个抗体检测而受限。今后的工作将继续增加病例数量，扩大检测抗体种类，并以免疫组化法进行组织定位，使结论更具有说服力。对诸多ARA致病性及致病机制的探索也是今后研究的方向。

作者简介

曾惠阳教授，北京同仁医院眼科研究所主任医师，研究员，研究生导师，北京市卫生系统高层次卫生技术人才。本科毕业于华西医科大学临床医学系，北京大学医学部获得眼科学博士学位。毕业后前往美国约翰·霍普金斯大学医学院Wilmer眼科研究所从事三年博士后研究并进修眼底内科。第一/通讯作者发表学术论文50余篇，包括《JAMA Ophthalmology》、《IOVS》、《Neuroscience》，《Eye》等SCI论文30余篇。先后主持国家自然科学基金、北京市自然科学基金、海外基金11项；参与的科研项目获得中华医学科技奖一等奖；第一发明人获国家发明专利3项，转化1项。京津冀国家创新中心项目评审专家；Graefe‘s Archive for Clinical and Experimental 杂志编委。

参考文献

[1] Grange L, Dalal M, Nussenblatt RB, et al. Autoimmune retinopathy. Am J Ophthalmol, 2014, 157（2）： 266一272.

[2]  Heckenlively JR,  Ferreyra  HA.  Autoimmune  retinopathy：  a  review and summary. semin Immunopathol, 2008, 30（2）： 127一134.

[3] Fox AR, Gordon LK, Heckenlively JR, et al. consensus on the diag — nosis  and  management  of nonparaneoplastic  autoimmune  retinopa — thy  using  a  modified delphi approach. Am  J  Ophthalmol,    2016, 168（2）： 183一190.

[4]  Forooghian  F,  cao  sJ,  cui J,  et  al.  The  enigma  of  autoimmune retinopathy. Int Ophthalmol clin, 2015, 55（2）： 81一91

[5] chan JW. paraneoplastic retinopathies and optic neuropathies. surv Ophthalmol,  2003, 48（1）： 12一38.

[6] 黄厚斌 ，魏世辉 ，李莹, 等. 副肿瘤性视神经视网膜病变临床特征 初步分析. 中华眼科杂志, 2013, 49（6）： 507一513.

[7]   Heckenlively   JR,   Fawzi   AA,  Oversier   J,  et  al.   Autoimmune retinopathy： patients with antirecoverin immunoreactivity and pan — retinal degeneration. Arch Ophthalmol, 2000, 118（11）： 1525一1533

[8] GrewalDs,Fisherman  GA, Jampol  LM. Autoimmune retinopathy and antiretinal antibodies： a review. Retina, 2014, 34（5）： 827一845

[9] sawyer RA, selhorst JB, zimmerman LE, et al. Blindness caused by photoreceptor degeneration as a remote effect of cancer. Am J Oph — thalmol, 1976, 81（5）： 606一613

[10] Maeda T, Maeda A, Maruyama I, et al. Mechanisms of photorecep — tor cell death in cancer一associated retinopathy. Invest Ophthalmol Vis sci, 2001, 42（3）： 705一712

[11] Weleber RG, Watzke Rc, shults WT, et al. clinical and electro — physiologic   characterization   of  paraneoplastic   and   autoimmune retinopathies  associated  with  antienolase  antibodies.  Am  J Oph — thalmol, 2005, 139（5）： 780一794.

[12] Adamus  G.  Autoantibody  targets  and  their  cancer  relationship  in the  pathogenicity  of  paraneoplastic  retinopathy.  Autoimmun  Rev, 2009, 8（5）： 410一414.

[13]  Forooghian  F.  prevalence  of  antiretinal  antibodies  in  acute  zonal occult outer retinopathy： a comprehensive review of 25 cases. Am J Ophthalmol, 2017, 179（2）： 210一211.

[14]  Ko  Ac,  Brington Jp,  Mahajan  VB,  et  al.  seroreactivity  against aqueous一soluble and detergent一soluble retinal proteins in posterior uveitis. Arch Ophthalmol, 2011, 129（4）： 415一420.

[15]  Adamus  G. Are  anti一retinal  autoantibodies  a cause or a conse — quence   of  retinal   degeneration   in   autoimmune   retinopathies?. Front Immunol, 2018, 9：765一777.